規(guī)格：50次
價(jià)格：5860元
產(chǎn)品及特點(diǎn)：
熒光定量PCR是在PCR體系中加入熒光化合物(熒光染料或熒光探針)。利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，使每個(gè)循環(huán)變得“可見”。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè).雙歧桿菌屬通用的試劑盒。
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù).雙歧桿菌屬通用高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病毒的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分
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編號(hào)
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十孔盒包裝
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探針法 qRT-PCR 緩沖液
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A
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500μL（黃蓋）
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探針法 qRT-PCR 酶混合液
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100μL（紅蓋）
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熒光 PCR 專用模板稀釋液
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C
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1 mL（黃蓋）
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.雙歧桿菌屬通用探針法 qRT-PCR引物混合液
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D
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100 μL（白蓋）
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.雙歧桿菌屬通用 qRT-PCR 探針
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E
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50 μL（棕色管）
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.雙歧桿菌屬通用探針法 qRT-PCR陽(yáng)性對(duì)照(1×10E8 拷貝/μL)
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F
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50 μL（黃蓋）
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核酸釋釋劑（試用裝）
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G
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20 次（1mL，綠蓋）
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使用手冊(cè)
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H
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一份
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運(yùn)輸及保存： 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。
自備試劑：樣品 RNA。
使用方法
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 RNA 的制備
7. 如果有N個(gè)樣品，好設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用10μL陽(yáng)性對(duì)照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。也以選購(gòu)本公司的柱式病毒RNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送20次免RNA提取的核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為RT-PCR模板，省略了RNA提取步驟。
三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR 管，其中N+2個(gè)用于上步得到的 N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4 個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照（用第4號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后加）：
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成分
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樣品管N+2個(gè)
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RT-PCR陰性對(duì)照管
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標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管
（2-7 管）
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探針法qPCR緩沖液
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各 10 μL
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10 μL
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各 10 μL
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探針法 qPCR 酶混合液
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各 2 μL
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2 μL
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各 2 μL
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.雙歧桿菌屬通用qRT-PCR探針
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各 1 μL
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1 μL
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各 1 μL
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.雙歧桿菌屬通用探針qRT-PCR
引物混合液
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各 2 μL
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2 μL
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各 2 μL
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待測(cè)樣品 RNA 模板
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各 5 μL
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超純水
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5 μL
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第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7 號(hào)）
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各5 μL（2號(hào)樣到2號(hào)管，3號(hào)樣到3 號(hào)管…）
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11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 qRT-PCR：
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過程
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溫度
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時(shí)間
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逆轉(zhuǎn)錄
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50℃
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30 min
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預(yù)變性
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94℃
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10 min
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qRT-PCR 反應(yīng)（40 個(gè)循環(huán)）
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94℃
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15 sec
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60℃
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1 min（采集 FAM 通道的熒光信號(hào)）
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五、數(shù)據(jù)處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 35，則為陽(yáng)性。
六、常見問題與解決方法:
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常見問題
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可能原因
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解決方法
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陽(yáng)性對(duì)照、待測(cè)樣本均無條帶。
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PCR反應(yīng)體系或反應(yīng)條件不合適。
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使用梯度PCR摸索PCR反應(yīng)條件。
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PCR試劑保存不當(dāng)失去活性。
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2× PCR Mix應(yīng)保存于-20℃，使用時(shí)避免反復(fù)凍融。若使用頻繁，可在4℃短時(shí)間存放。
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引物設(shè)計(jì)問題。
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嘗試重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢查。
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陽(yáng)性對(duì)照有目的條帶，待測(cè)樣本無條帶或條帶弱。
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不當(dāng)儲(chǔ)存或長(zhǎng)期儲(chǔ)存引起試劑活性喪失。
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使用新鮮的試劑。
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加入組織裂解液過量。
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增大反應(yīng)體系，或減少裂解液的用量。
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樣本裂解混合液保存不當(dāng)或保存時(shí)間過久，DNA基因組已經(jīng)降解。
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裂解混合液液可在4℃保存2-3天，盡量使用新制備的裂解液混合液進(jìn)行PCR。
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模板加入量不適合。
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在反應(yīng)體系10-20%范圍內(nèi)優(yōu)化模板加入量。反應(yīng)效性能較差時(shí)，可以降模板濃度調(diào)節(jié)到低于10%的范圍。
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PCR循環(huán)數(shù)不足。
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適當(dāng)增加PCR的循環(huán)數(shù)，推薦在35-40循環(huán)為佳。因?yàn)槟０鍙?fù)雜，一般PCR反應(yīng)要比用純化的 DNA模板多5-10個(gè)循環(huán)為佳。
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非特異性擴(kuò)增
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PCR退火溫度太低，循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度太高。
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增加PCR退火溫度，降低PCR循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度。
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PCR引物錯(cuò)配。
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重新設(shè)計(jì)PCR引物。
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配制PCR反應(yīng)體系時(shí)溫度太高或配制完成后放置時(shí)間太久。
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PCR反應(yīng)體系的配制在低溫下進(jìn)行，配制完成后盡快進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
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陰性對(duì)照出現(xiàn)目的條帶
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操作工具或試劑污染。
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實(shí)驗(yàn)所有試劑或器材均應(yīng)高壓滅。操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。
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樣本間交叉污染。
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每個(gè)取樣器只對(duì)一個(gè)樣本使用；或取完一個(gè)樣本后，將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中，反復(fù)涮洗，然后用干凈的紙巾擦干殘液。
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