**印跡的基本原理、實驗步驟

Western Blot原理

       Western Blot（**印跡）采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。SDS-PAGE可對蛋白質(zhì)樣品進行分離，轉移到固相載體——例如硝酸纖維素薄膜（NC）上。固相載體可以吸附蛋白質(zhì)，并保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。轉移后的NC膜就稱為一個印跡（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脫脂奶粉溶液）處理，封閉NC膜上的疏水結合位點。用目標蛋白的抗體（一抗）處理NC膜——只有待研究的蛋白質(zhì)才能與一抗特異結合形成抗原抗體復合物，這樣清洗除去未結合的一抗后，只有在目標蛋白的位置上結合著一抗。用一抗處理過的NC膜再用標記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。處理后，帶有標記的二抗與一抗結合形成抗體復合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。
       Western Blot實驗試劑及儀器
       1.試劑準備
      （1）甲醇
      （2）轉移緩沖液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g  SDS 0.37g 甲醇200ml  V=1L）
      （3）一抗，二抗
      （4）PBST，PBS，Tween-20
      （5）顯影液（5X）：
       自來水（加熱至 50℃） 375ml （以下藥品加到溫水中）
       米吐爾 1.55g， 亞硫酸鈉（無水） 22.5g， 碳酸鈉（無水） 33.75g， 溴化鉀 20.95g，補水至 500ml
      （6）定影液：
       自來水（50～60℃） 700ml （以下藥品按順序加入前者溶解后再加后者）
       硫代硫酸鈉 240g， 亞硫酸鈉（無水） 15g， 冰乙酸 12.6ml，硼酸 7.5g，鉀明礬 15g（水溫冷至 30℃以下時再加入），加水定容至 1000ml，室溫保存
       2. 材料準備
       轉膜用的夾子，兩塊海綿墊，一支滴管，兩張濾紙，一張PVDF膜，轉膜槽，轉移電泳儀，搖床，計時器，磁力攪拌器，轉子，Western blot 盒，一塊SDS-PAGE膠，脫脂奶粉
       實驗步驟

       1.將玻璃板洗凈，*后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。 
       2.分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲存液避光存放于4℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導致氣泡），加入10%AP及TEMED即可。 
       3.封膠：灌入2/3的分離膠后應立即封膠，膠濃度＜10%時可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時用異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS，封膠后靜置至膠凝固。待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力**殘留水滴。
       4.灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時防止氣泡進入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當粗細的針頭撥正。30min后上樣，長時間有利于膠結構的形成，因為肉眼觀的膠凝時其內(nèi)部分子的排列尚未完成。(10%的AP*好現(xiàn)配現(xiàn)用，如在4℃存放勿超過兩周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，*好棄掉) 

       (二) 樣品處理 
       培養(yǎng)的細胞（定性）  
       1.去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。 
       2.對于6孔板來說每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。 
       3.刮下的細胞在EP管中煮沸10min，期間vortex 2~3次。 
       4.用干凈的針尖挑絲，將團塊棄掉，如果沒有團塊但有拉絲現(xiàn)象，可將EP管置于0℃后在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無團塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反復抽吸來降低溶液粘滯度，便于上樣。 
       5.待樣品恢復到室溫后上樣。 
 
        培養(yǎng)的細胞（定量）  
       1.去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。 
       2.加入適量的冰預冷的裂解液后置于冰上10~20min。 
       3.刮下的細胞收集在EP管后超聲（100~200w）3s，2次。 
       4.12000g離心，4℃，2min。 
       5.取少量上清進行定量。 
       6.將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣*好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。 
       3. 組織  
       1.心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手動或電動勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。 
       2.12000g離心，4℃，2min。 
       3.取少量上清進行定量。 
       4.將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣*好，低溫儲存剩余溶液（溶于1×loading buffer），每次上樣前98℃，3min。 
 
       (三) SDS-PAGE電泳(不用染色)  
       使待測樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶。關于SDS-PAGE實驗操作原理及FAQ參考  

       (四) 轉膜

       電泳結束前20分鐘左右戴上手套開始準備  
       1、準備：轉移緩沖液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g  SDS 0.37g 甲醇200ml  V=1L）、轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支滴管、2張濾紙、一張PVDF膜。 
       2、剪切濾紙和膜時一定要戴一次性PE手套，避免手上的蛋白污染膜。轉膜前，PVDF膜應在甲醇溶液中浸泡5-10秒，浸濕為止，在平衡液中平衡（甲醇的作用是固定大分子蛋白，使小分子物質(zhì)易轉移出去） 
       3、將轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支滴管、2張濾紙、一張PVDF膜浸泡在轉移緩沖液中，然后取出SDS-PAGE膠，將濃縮膠輕輕刮去，并在膠的一角做一缺角作為標記以區(qū)分上樣順序。將膠在轉膜緩沖液中浸泡5min左右，以平衡離子強度。 
       4、夾子打開平放底部黑色電極(陰極)，放一張海綿墊片，用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。在海綿墊片上放置1張轉移緩沖液浸泡過的濾紙，對齊，然后用一玻璃棒作滾筒以擠出所有氣泡，必要時可滴加轉膜液潤濕。取出浸在轉膜液中的凝膠平放在濾紙上，排除所有氣泡。將PVDF膜置于聚丙烯酰胺凝膠上，玻棒來回搟幾遍排除所有氣泡，注意在膜的正面作上標記（可以將膜的一角剪去或用簽字筆在膜的邊角上做記號）。在膜上蓋一張轉移緩沖液浸泡過的濾紙，同樣須確保不留氣泡。*后蓋上另一張海綿墊，蓋上陽極板（白色），夾緊。保證對凝膠有一定壓力。 
       5、將夾子放入轉移槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。轉膜時將轉移槽放入冰水中進行。轉膜過程中電轉液用磁力攪拌器攪拌。一般用恒壓110V轉移60min。對于大分子量的蛋白（超過120KD），時間約80min。特別要注意加強降溫措施。 
       (五) **學檢測 
       1、 取膜，將膜正面朝上在1xPBST溶液中搖動五分鐘，洗一次，移至含有封閉液（含10％脫脂奶粉的 瓶PBST 緩沖液；脫脂奶粉5g，PBST 100ml，溶解后 4℃保存。使用時，恢復室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用。）的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1小時。注：10%脫脂牛奶的作用：用大分子物質(zhì)封閉非相關的蛋白結合位點，降低非特異性結合（抗體與膜），同時也使背景色不高。PBST：T為吐溫，減少非特異性吸附，不影響抗體抗原的結合。 
       2、 取出膜在1xPBST溶液中洗5分鐘，搖動，洗兩次，放入1xPBST緩沖液中（內(nèi)含5%脫脂牛奶），同時加入一抗與二抗到緩沖液中，孵育60min。 
       3、 用1xPBST洗至少三次，5min/次 
       4、 化學發(fā)光，顯影。顯影液與水1:4，定影液與水1:9，發(fā)光液 
       注：顯影液（5X）： 
       自來水（加熱至 50℃） 375ml （以下藥品加到溫水中） 
       米吐爾 1.55g 
       亞硫酸鈉（無水） 22.5g 
       碳酸鈉（無水） 33.75g 
       溴化鉀 20.95g 
       補水至 500ml 
       配制時，上述藥品應逐一加入，待一種試劑溶解后，再加入后一種試劑。4℃保存。使用時用自來水稀釋至 1 倍。 
       定影液： 
       自來水（50～60℃） 700ml （以下藥品按順序加入前者溶解后再加后者） 
       硫代硫酸鈉 240g 
       亞硫酸鈉（無水） 15g 
       冰乙酸 12.6ml 
       硼酸 7.5g 
       鉀明礬 15g（水溫冷至 30℃以下時再加入） 
       加水定容至 1000ml，室溫保存 
       發(fā)光液：魯米諾試劑2ml、過氧化氫1.3ml 

       5、 在暗室中，將 1×顯影液（50ml）和定影液（50ml）分別到入塑料盒中；在紅燈下取出 X－光片，用切紙刀剪裁適當大小（比膜的長和寬均需大 25px）；打開 X-光片夾，將膜放入X-光片夾，并將發(fā)光液均勻涂抹在膜上，之后把 X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關上 X-光片夾，開始計時；根據(jù)信號的強弱適當調(diào)整曝光時間，一般為 1min 或 5min，也可選擇不同時間多次壓片，以達*佳效果；曝光完成后，打開 X-光片夾，取出 X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間一般為 1～2min（20～25℃），溫度過低時（低于 16℃）需適當延長顯影時間；顯影結束后，馬上把 X-光片浸入定影液中，定影時間一般為 5～10min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。

       (六) 注意事項  

       1.顯影和定影需移動膠片時，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片，否則會對結果產(chǎn)生影響。 

       2.一抗，二抗的孵育時間因抗體不同可做適當?shù)恼{(diào)整。 
       3.轉膜時濾紙與膠，膠與膜，膜與濾紙之間不能有氣泡，必須用玻棒搟走。有氣泡會影響轉膜效果。 
       4.把 X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動