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細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)問題及解答

日期:2025-02-16 16:18
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摘要: 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)問題及解答 小牛血清和胎牛血清有何區(qū)別?應(yīng)用注意事項(xiàng)? 來源不同:胎牛血清(Fetal Bovine Serum ,FBS) 是在屠宰懷孕母牛的時(shí)候,通過心臟穿刺采血獲取的胎牛的血清,新生牛(小牛)血清(Calf serum, CS)采自出生10至14 天的小牛。 組份與比例不同:兩者所含的促細(xì)胞生長因子、促貼附因子、**及其他活性物質(zhì)等組份與比例不同,用途與用法不同:某些細(xì)胞必需胎牛血清才能生長,而有些細(xì)胞只需小牛血清即可,使用濃度不同,一般在5%-10%,有特殊要求的濃度在20%。 ...

細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)問題及解答

小牛血清和胎牛血清有何區(qū)別?應(yīng)用注意事項(xiàng)?



來源不同:胎牛血清(Fetal Bovine Serum ,FBS) 是在屠宰懷孕母牛的時(shí)候,通過心臟穿刺采血獲取的胎牛的血清,新生牛(小牛)血清(Calf serum, CS)采自出生10至14 天的小牛。

組份與比例不同:兩者所含的促細(xì)胞生長因子、促貼附因子、**及其他活性物質(zhì)等組份與比例不同,用途與用法不同:某些細(xì)胞必需胎牛血清才能生長,而有些細(xì)胞只需小牛血清即可,使用濃度不同,一般在5%-10%,有特殊要求的濃度在20%。

血清保存和使用須注意:血清應(yīng)保存在-5℃至-20℃,若存放在4℃不可超過一個月。解凍血清時(shí),應(yīng)先將血清至于2-8℃冰箱,并經(jīng)常搖勻使之溶解,然后至室溫放置使之升溫,**不可將冷凍的血清直接放入37℃水浴或者溫箱中,如放在37℃解凍,顏色加深,粘稠度也會增加,血清在解凍和熱滅活后,應(yīng)按用量分裝并于-20℃保存,避免反復(fù)凍融。

胰酶消化傳代的濃度是多少?是否含EDTA?濃度?

胰酶消化傳代的一般濃度為0.25%,部分細(xì)胞由于貼壁較緊,需要加0.53mM 的EDTA,如果做原代培養(yǎng),胰酶的濃度需要做適當(dāng)?shù)奶岣摺?

 


常用細(xì)胞株推薦的培養(yǎng)基及特殊要求?


常規(guī)培養(yǎng)基的選用一般原則,懸浮培養(yǎng)細(xì)胞以RPMI1640為主、貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞以DMEM為主,部分細(xì)胞需用特殊培養(yǎng)液來培養(yǎng),如Mccoy’5A、L-15、F12K、D+F12 等等。


細(xì)胞株的污染鑒定、預(yù)防和處理問題。



普通微生物污染:培養(yǎng)基渾濁,高倍鏡觀察有微生物污染;按規(guī)定棄用并**嚴(yán)格**。

支原體污染:顯微鏡無法觀察,依經(jīng)驗(yàn)表現(xiàn)為細(xì)胞生長緩慢,有細(xì)胞漂浮等等,應(yīng)通過pcr 等方法鑒定,如發(fā)現(xiàn)支原體污染,應(yīng)按規(guī)定棄用,實(shí)驗(yàn)室要及時(shí)******,防止蔓延。(有些常規(guī)性細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)不受支原體污染影響,可以繼續(xù)使用細(xì)胞傳代,為防污染擴(kuò)大蔓延,可以選擇性的在培養(yǎng)基中加入高效價(jià)的其它種***,并在隔離實(shí)驗(yàn)室操作和獨(dú)立使用一切用具與培養(yǎng)基等)。

 


如何傳代貼壁細(xì)胞?




細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后,已基本上飽和,為使細(xì)胞能繼續(xù)生長,同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大,就必須進(jìn)行傳代(再培養(yǎng))。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程。

懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以,而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。一般使用蛋白水解酶(比如胰蛋白酶)消化貼壁細(xì)胞成單個細(xì)胞,也可加入乙二胺四乙酸(EDTA)提高消化能力,EDTA 是一種二價(jià)離子的螯合劑,能抑制細(xì)胞膜上的Ca2+和Mg2+。常用的細(xì)胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA,一般用不含Ca2+和Mg2+的鹽溶液配置,先用胰酶-EDTA 消化液清洗細(xì)胞(5.0 -10.0 ml/75cm),然后棄去消化液,重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(2.0 to 5.0 ml/75 sq. cm flask),觀察細(xì)胞直到細(xì)胞變圓脫離瓶壁,此過程一般需要5-15分鐘,為了避免細(xì)胞成團(tuán),消化細(xì)胞的過程中不要拍打細(xì)胞瓶。對于特別難消化的細(xì)胞,可以加入胰酶EDTA 消化液后把細(xì)胞置于37°C 促進(jìn)消化,細(xì)胞脫離瓶壁后,立刻加入含有血清的完全培養(yǎng)基中止消化,血清中某些蛋白質(zhì)能夠抑制胰酶的活性。

一般情況下,離心并不需要。如果細(xì)胞需要無血清或者低血清的培養(yǎng)基,可以以125000g 轉(zhuǎn)速離心5分鐘,然后棄去中止用的培養(yǎng)基,加入適合的新的培養(yǎng)基輕輕混勻細(xì)胞,移入到新的培養(yǎng)瓶。傳代的比例視細(xì)胞類型而定,一般是1:2-1:20,具體比例可參考說明書。胰蛋白酶會對某些細(xì)胞的細(xì)胞膜產(chǎn)生損傷,對于這種類型的細(xì)胞,可用細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞,加入適量的培養(yǎng)基,輕輕吹打混勻細(xì)胞,然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。


傳代細(xì)胞的頻率多久較合適?



傳代是指把細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶移到另一個培養(yǎng)瓶,傳代的間隔是指兩次傳代之間的時(shí)間。

貼壁型的細(xì)胞的匯合度達(dá)到或者接近100%的時(shí)候,需進(jìn)行傳代操作,但是,有些細(xì)胞以克隆的形式生長,匯合度永遠(yuǎn)達(dá)不到100%,對于這種類型的細(xì)胞,細(xì)胞達(dá)到或者接近*大密度的時(shí)候,就需傳代。接觸抑制型細(xì)胞(比如3T3)需要在細(xì)胞長滿之前傳代以避免產(chǎn)生細(xì)胞長滿后接觸抑制后產(chǎn)生性狀的改變。懸浮型的細(xì)胞必須在細(xì)胞達(dá)到*大飽和密度之前傳代,懸浮細(xì)胞傳代時(shí)只需稀釋至合適的密度,讓細(xì)胞有充足的營養(yǎng)恢復(fù)到對數(shù)生長期。

如果僅僅是簡單的換液,而且細(xì)胞數(shù)量不減少,細(xì)胞將會快速耗盡營養(yǎng)而死亡;如果細(xì)胞稀釋到*低密度之下,細(xì)胞將會進(jìn)入停滯期而不增殖或者死亡。不同的懸浮細(xì)胞的*大飽和密度和傳代的間隔與比例是不同的,所以,培養(yǎng)懸浮細(xì)胞要每日觀察。

如何處理對于生物**性不清楚地腫瘤細(xì)胞株?

了解每株細(xì)胞可能產(chǎn)生的生物危害是很難的,但是強(qiáng)烈推薦,所有的人類和其他靈長類生物的細(xì)胞在能否預(yù)防HIV和肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)條件下操作,所有的操作必須在垂直層流超凈臺內(nèi)操作(推薦生物**柜),操作過程中產(chǎn)生的廢液和廢儀器都要經(jīng)過清洗、酸處理等處理后才能丟棄。

 


能否使用細(xì)胞說明書上不同的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞?


產(chǎn)品目錄或者細(xì)胞說明書上的推薦的培養(yǎng)基一般是細(xì)胞株的原始提供者推薦的培養(yǎng)基或者已經(jīng)經(jīng)過驗(yàn)證的對該細(xì)胞株*合適的培養(yǎng)基,細(xì)胞對未推薦的培養(yǎng)基也許會適應(yīng),也有可能不適應(yīng)。對于更換培養(yǎng)基,應(yīng)謹(jǐn)慎對待,更換培養(yǎng)基時(shí),應(yīng)留一瓶細(xì)胞使用推薦的培養(yǎng)基培養(yǎng),留作種子。

更換培養(yǎng)基有兩種方法,*簡單的方法是直接更換培養(yǎng)基,強(qiáng)制使細(xì)胞適應(yīng)新的培養(yǎng)基;還有一種更溫和的方法:傳代細(xì)胞的時(shí)候分成細(xì)胞兩瓶,**瓶使用原來推薦的培養(yǎng)基,**瓶使用50%原來推薦的培養(yǎng)基,50%新的培養(yǎng)基,之后仔細(xì)觀察細(xì)胞的生長狀態(tài),如果**瓶細(xì)胞生長狀態(tài)不好,應(yīng)立即停止更換培養(yǎng)基,如果**瓶生長狀態(tài)好,可以繼續(xù)傳代分瓶,一瓶使用50%原來推薦的培養(yǎng)基,50%新的培養(yǎng)基,另一瓶使用25%原來推薦的培養(yǎng)基,75%新的培養(yǎng)基,繼續(xù)觀察,如果細(xì)胞狀態(tài)好,可以全部換成新鮮的培養(yǎng)基。

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