利用熒光標(biāo)記法測定細胞凋亡因子具體操作方法

一、儀器與試劑 
1. TdT酶（25U/μl）；
2. 生物素標(biāo)記的-dUTP（Biotin-dUTP）或地高辛標(biāo)記的dUTP （Digoxingening-11-dUTP）1nmol/μl；
3. 反應(yīng)緩沖液； 
4. 洗滌緩沖液； 
5. 異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的親合素或鏈霉親合素 （2.5μg/ml）或抗地高辛抗體（1:30）；
6. PI染液（含PI 5μg/ml及0.1%無DNA酶活性的RNA酶）； 
7. PBS緩沖液；
8. 塑料蓋玻片； 
9. 貼壁生長的培養(yǎng)細胞； 
10. 懸浮生長培養(yǎng)細胞的甩片或涂片；冰凍切片；常規(guī)石蠟切片。
二、操作步驟
1. 固定：培養(yǎng)細胞的制片或冰凍切片用4％多聚甲醛固定30min（4℃冰箱）后，用80%酒精再固定2h（-20℃冰箱）；常規(guī)4%中性福爾馬林固定、石蠟切片進行脫蠟、水合； 2. 洗滌：將玻片浸入PBS緩沖液，搖床上洗滌5min，三次；
3. 反應(yīng)：洗滌后的玻片用吸水紙吸干細胞或組織周圍水分，按50μl/cm2 滴加反應(yīng)液（每50μl反應(yīng)液含TdT酶0.5μl ，標(biāo)記的-dUTP 1μl），使反應(yīng)液均勻地覆蓋于所有細胞或組織切片上，蓋上塑料蓋玻片，置濕盒中，37℃孵育1h；
4. 終止反應(yīng)：去掉塑料蓋玻片，將玻片置于盛有洗滌緩沖液的染色缸內(nèi)，洗滌2次，每次5min；
5. FITC標(biāo)記：洗滌后的玻片用吸水紙吸去細胞或組織周圍水分，按50μl/cm2滴加FITC反應(yīng)液（含F(xiàn)ITC 2.5μg/ml），室溫下避光孵育10min；
6. 洗滌：將玻片置于洗滌緩沖液內(nèi)，洗2次，每次5min；
7. PI復(fù)染：將玻片置于盛有PI染液的染色缸內(nèi)，室溫下避光染色30min 8. 封片：用蓋玻片直接蓋在含PI染液的玻片上，亦可用無色指甲油涂于蓋玻片四周邊緣，置暗盒中，盡早鏡檢觀察；
三、結(jié)果判斷     
用熒光顯微鏡觀察，選用藍色激發(fā)光（波長488nm），所有的細胞核均被PI著色，顯示出紅色熒光，而凋亡細胞被特異地標(biāo)記上FITC，顯示出黃綠色熒光。