內(nèi)**對(duì)ELISPOT檢測(cè)的干擾
l 背景知識(shí)
我們都知道,內(nèi)**的化學(xué)本質(zhì)是革蘭氏陰性**的脂多糖。它可以激活**細(xì)胞的受體TLR4 (Toll like receptor4)和TLR2,從而引發(fā)**細(xì)胞內(nèi)一系列的反應(yīng),包括產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子,從而啟動(dòng)先天**應(yīng)答(Poltorak, A. et. al., 1998)。
實(shí)際上,內(nèi)**只是一大類能通過(guò)TLR受體家族激活先天**系統(tǒng)的供體中的一種。其它的供體還包括**共有的Lipopetide、脂蛋白(Lipoprotein)、鞭毛蛋白(Flagellin)(vison, S. M et. al., 2007);革蘭氏陰性菌的多聚甘露糖醛酸(Mannuronic acid polymer)、非典型脂多糖(Atypical lipopolysaccharide)、外膜脂蛋白A、膜孔道蛋白(Porin)、外膜蛋白A(Outer membrane protein A)、菌體糖脂質(zhì)(Glycolipid)、菌毛蛋白A(CsgA);革蘭氏陽(yáng)性菌的肽聚糖、磷壁酸;分枝桿菌中特有的三乙酰化脂蛋白(Triacetylated lipoprotein)、二乙酰化脂肽(Diacetylated lipopeptide)、脂阿拉伯甘露糖(Lipoarabinomannan)、結(jié)核分支桿菌的結(jié)核素(STF);支原體的二乙酰化脂肽;錐蟲的糖肌醇磷脂(Glycoinositolphospholipids),弓形蟲的Profilin-like protein;**的酵母聚糖;病毒的未甲基化CpG DNA、 ssRNA、 dsRNA,某些病毒的膜蛋白與膜融合蛋白。
這些外源病原性的供體刺激TLR受體家族之后,共有4條信號(hào)通路,包括:1依賴于MyD88(骨髓分化基因)信號(hào)通路,這是主要通路;2不依賴于MyD88信號(hào)通路;3Small GTPase信號(hào)通路;4PIP信號(hào)通路。四條通路也相互偶聯(lián)成網(wǎng),激活后面的效應(yīng)途徑,包括有絲分裂原激活的蛋白激酶途徑(mitogen-activated protein kinase, MAPK)和NF-κB途徑等等(Oda, K et. al., 2006)。
一旦這些非特異性細(xì)胞**途徑激活,作為檢測(cè)特異性細(xì)胞**的ELISPOT檢測(cè)必然會(huì)受到干擾。屆時(shí),我們將無(wú)法區(qū)別哪些斑點(diǎn)是特異性抗原刺激產(chǎn)生的,哪些是非特異性的細(xì)胞**反應(yīng)產(chǎn)生的。所以,增加ELISPOT檢測(cè)可信度,提高檢測(cè)重復(fù)性的一個(gè)重要環(huán)節(jié)就是要嚴(yán)格控制好以內(nèi)**為首的可能干擾ELISPOT檢測(cè)的各種TLR供體。
l 應(yīng)對(duì)措施
實(shí)際實(shí)驗(yàn)中,*容易出現(xiàn)的TLR供體干擾來(lái)源是微生物的污染,包括**、**和酵母。為了盡可能避免內(nèi)**對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的干擾,重點(diǎn)要做好以下幾個(gè)方面:
1選擇高品質(zhì)的ELISPOT試劑盒,試劑盒內(nèi)的成分應(yīng)該盡量完整。我們推薦達(dá)科為/U-Cytech公司的產(chǎn)品。該產(chǎn)品的質(zhì)量已為國(guó)內(nèi)客戶多年的使用所證實(shí),并且試劑盒內(nèi)的各種成分非常齊備,除客戶必須自備的Milli Q和PBS之外,客戶不需要自行準(zhǔn)備其它試劑,避免了引入各種TLR供體而干擾實(shí)驗(yàn)。
作為對(duì)比,BD公司和Diaclone公司的ELISPOT試劑需要客戶自行準(zhǔn)備封閉液以及抗體稀釋液,Mabtech公司更是只提供抗體對(duì)。特別指出:自行準(zhǔn)備的封閉液,封閉之后會(huì)直接接觸檢測(cè)細(xì)胞,引入受污染的微生物或者內(nèi)**是很普遍的。這就會(huì)導(dǎo)致背景變臟,負(fù)對(duì)照產(chǎn)生額外的斑點(diǎn),并且實(shí)驗(yàn)孔中特異性的斑點(diǎn)與非特異性的斑點(diǎn)混雜,*終影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性與可信度。
ELISPOT檢測(cè)中,無(wú)菌操作部分需要的各種溶液應(yīng)該在潔凈的空間內(nèi)(比如超凈臺(tái)內(nèi))配制,盡量采用過(guò)濾**的方式。以未包被ELISPOT試劑為例,需要保持嚴(yán)格潔凈的溶液有:潤(rùn)濕PVDF膜的酒精、洗滌用超純水或者PBS、包被抗體以及抗體稀釋液、封閉液、培養(yǎng)基、刺激物。
在潔凈的空間內(nèi)配制可以有效避免灰塵以及其它污染物。采用過(guò)濾**可以有效濾**體,如果用高壓**,容易引起生物活性成分失活,而且死亡的菌體反而會(huì)釋放出更多的TLR供體成分。
使用無(wú)內(nèi)**的各種耗材、器皿。有些實(shí)驗(yàn)室習(xí)慣于使用一次性塑料耗材培養(yǎng)細(xì)胞或者做實(shí)驗(yàn),這些耗材確實(shí)使用方便,并且能避免污染。但對(duì)于ELISPOT檢測(cè)而言,*好選用已經(jīng)表明不含熱源的品牌。如果使用可重復(fù)使用的玻璃器皿,注意嚴(yán)格浸泡洗液,嚴(yán)格清洗。內(nèi)**或者某些TLR供體的化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定,只有在濃硫酸/重鉻酸鉀的洗液中或者170°C烘烤4小時(shí)才會(huì)完全分解。
使用高質(zhì)量的刺激物。
使用達(dá)優(yōu)®無(wú)血清培養(yǎng)基。
*嚴(yán)格的無(wú)菌操作。
總之,內(nèi)**以及其它TLR供體是ELISPOT檢測(cè)中一大類干擾源。它們并不會(huì)導(dǎo)致ELISPOT檢測(cè)的完全失敗,故初學(xué)者這些干擾源不會(huì)太在意。但是要獲得高質(zhì)量的檢測(cè)結(jié)果,增加實(shí)驗(yàn)的可信度與重復(fù)性,一個(gè)進(jìn)階的實(shí)驗(yàn)者必須考慮這些問(wèn)題了。